DirectPCR Lysis Reagent (Cell)

細(xì)胞直接PCR裂解液 裂解+PCR一步到位

           Cat#301-C/302-C

產(chǎn)品關(guān)鍵詞：

Viagen Biotech; DirectPCR® 直接PCR；PCR genotyping 基因分型；Proteinase K蛋白酶K；301-C/ 302-C；

產(chǎn)品介紹：

Viagen DirectPCR® DNA提取系統(tǒng)是一種單管式快速DNA制備系統(tǒng)，適用于小鼠尾組織、耳組織、卵黃囊及培養(yǎng)細(xì)胞。該技術(shù)采用Viagen Biotech Inc.科學(xué)家研發(fā)的組分，確保提取的DNA可直接用于基因組PCR分型。動(dòng)物組織與細(xì)胞中的某些成分會(huì)抑制PCR反應(yīng)。DirectPCR裂解試劑含有特異性抑制因子，可中和此類PCR抑制物。因此，經(jīng)DirectPCR試劑釋放的DNA可直接用于一步法PCR基因分型。DirectPCR試劑不僅能介導(dǎo)生物樣本的快速裂解，其抑制因子還可有效中和粗提液對(duì)PCR擴(kuò)增的抑制活性，同時(shí)最大限度保持釋放的基因組DNA完整性。該裂解液簡易操作流程避免了溶液轉(zhuǎn)移或開管步驟，為您節(jié)省大量額外時(shí)間。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

與傳統(tǒng)方法相比，DirectPCR®系統(tǒng)具有以下顯著優(yōu)勢(shì)：

· 省時(shí)：操作時(shí)間更短，粗提裂解液可直接用于PCR

· 經(jīng)濟(jì)：性價(jià)比高

· 安全：不含有機(jī)試劑

· 環(huán)保：減少廢棄物產(chǎn)生（有機(jī)試劑、離心管、槍頭等）

· 穩(wěn)定高效：成功率近100%，且DNA得率高

操作流程：（細(xì)胞直接PCR裂解液）

1.   將10cm培養(yǎng)板中的細(xì)胞懸浮于200-300µl DirectPCR裂解試劑（細(xì)胞）中，試劑需含有新鮮配制的0.2-0.4mg/ml蛋白酶K（Sigma，產(chǎn)品編號(hào)p6556，不包含）。蛋白酶K在DirectPCR試劑中可穩(wěn)定存在約24小時(shí)。如果處理的細(xì)胞數(shù)量較少，難以稱量蛋白酶K干粉，可使用基因組PCR級(jí)蛋白酶K溶液（Viagen Cat#501-PK），濃度為0.5-1.0 mg/ml（每1 ml DirectPCR試劑加入25-50µl蛋白酶K溶液）。

注意：對(duì)于少量細(xì)胞，可將DirectPCR試劑用蒸餾水稀釋至多10倍，然后按比例增加裂解液體積用于PCR（見表1）。

2.   將試管置于55℃的旋轉(zhuǎn)雜交爐中旋轉(zhuǎn)5-6小時(shí)，直至無團(tuán)塊可見。如有需要，可旋轉(zhuǎn)過夜，效果不會(huì)降低。充分裂解非常重要。為獲得可重復(fù)的結(jié)果，建議在2-3小時(shí)后搖動(dòng)裝有試管的瓶子，重新調(diào)整試管位置。

注意：旋轉(zhuǎn)雜交爐的效果優(yōu)于搖板。對(duì)于少于150 µl DirectPCR試劑（細(xì)胞）的情況，使用0.75 cm試管。長時(shí)間旋轉(zhuǎn)導(dǎo)致的DNA斷裂不會(huì)顯著影響PCR效果。對(duì)于不同大小的樣本，按比例使用DirectPCR裂解試劑。

3.   將粗裂解液在85°C水浴中孵育45分鐘，將整個(gè)試管架漂浮于水浴上。（可選）在步驟4之前，離心10秒以沉淀雜質(zhì)。粗裂解液可在-20℃保存1年（或在4℃保存1周），效果不會(huì)降低。

4.   每50 µl PCR反應(yīng)使用0.5-1µl裂解液。推薦使用Eppendorf Hotmaster Taq聚合酶（cat#954-14-5018）、Sigma JumpStart Taq DNA聚合酶（產(chǎn)品編號(hào)D9307）或Qiagen HotStar Taq DNA聚合酶（產(chǎn)品編號(hào)203203）進(jìn)行PCR。

DNA回收：粗裂解液中的DNA可回收用于進(jìn)一步分析。加入NaCl至終濃度為250 mM，然后加入0.7體積的異丙醇。DNA將形成沉淀。4℃離心2分鐘，棄上清，用1 ml 70%乙醇洗滌DNA，溶解于50µl 10mM Tris-HCl（8.0）中。取1µl用于PCR。

表1. 培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞建議起始裂解條件

^*使用旋轉(zhuǎn)雜交爐裂解。** 使用搖板裂解。用磷酸鹽緩沖液洗滌96孔板中的細(xì)胞兩次，加入60µl 2倍稀釋的DirectPCR試劑（細(xì)胞）。55℃孵育過夜。將96孔板置于濕盒中，漂浮于85℃水浴上1.5小時(shí)。多次吸打混勻。取1ul裂解液用于PCR。

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